Mia Dželalija

Obrana će se održati:

PONEDJELJAK, 15. srpnja 2024. godine u 10.00 sati

u dvorani BO-P3 soba 213, PMF, Ravnice 48, Zagreb

Disertacija nosi naslov:

Seasonal and spatial distribution of antibiotic resistance in marine microbial communities along a trophic gradient in central Adriatic Sea

Sezonska i prostorna raspodjela rezistencije na antibiotike u morskim mikrobnim zajednicama duž trofičkog gradijenta u srednjem Jadranu

Povjerenstvo za obranu rada:

prof. dr. sc. Martina Šeruga Musić, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb

prof. dr. sc. Mirna Mrkonjić Fuka, Agronomski fakultet, Zagreb

izv. prof. dr. sc. Ana Bielen, Prehrambeno-biotehnološki fakultet, Zagreb

Zamjena: prof. dr. sc. Ivana Ivančić Baće, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb

Mentor: izv. prof. dr. sc. Ana Maravić, Prirodoslovno-matematički fakultet u Splitu

Sažetak:

Bakterijska rezistencija na antibiotike (AR) je globalni problem današnjice te je u skladu s konceptom „Jednog zdravlja“ (eng. One health)  važno provoditi simultani nazdor i kontrolu u cjelokupnom prirodnom okolišu. Mora i oceani su najveći ekosustavi u svijetu ali su sa aspekta sastava rezistoma i glavni patogenih nositelja AR najmanje istraženi.

Cilj ovog doktorskog rada je bio istražiti sezonske i prostorne značajke AR u morskim mikrobnim zajednicama niz trofički gradijent srednjeg Jadrana duž 68 km od estuarija rijeke Jadro koja je pod utjecajem otpadnih voda, do obalnog i otvorenog mora. Terenskim istraživanjem profilirano je osamdeset mikrobioma korištenjem 16S rRNA sekvenciranja te je određen taksonomski sastav autohtone morske zajednice kao i rezistoma pri dnu i površini morskog stupca vode.

Pri tom je otkriveno kako na biogeografske pomake uvelike utječu sezonske promjene, osobito termohalina stratifikacija i zastupljenost organskih tvari. Također, najbogatiji sastav i raznolikost morskog mikrobioma uočena je u područjima visoke antropogene aktivnosti, dok su najudaljenija mjerenja od obale pokazala manju taksonomsku raznolikost. Također, utvrđeno je kako antropogeni utjecaji uvelike oblikuju mikrobnu raznolikost. Tijekom zime, pod utjecajem otpadnih voda s kopna, koljena Proteobacteria i Firmicutes prevladavali su duž trofičkog gradijenta te su bili glavni doprinositelji morskog rezistoma. Najzastupljeniji patogeni rodovi na površini eutrofnog područja tijekom ljeta bili su Arcobacter, Acinetobacter, Bacteroides, Prevotella, Pseudomonas i Streptococcus, što je izravna posljedica dotoka otpadnih voda. Posljedično, ovi rodovi, posebno Arcobacter, Acinetobacter, Bacteroides i Pseudomonas, značajno su pridonijeli AR u priobalnom dijelu. Ciljani geni AR kvantificirani su pomoću RT-qPCR, među kojima je distribucija tetA, bla_CTX-M i bla_TEM u korelaciji s višom temperaturom, opterećenjem hranjivim tvarima i nižim salinitetom. Patogeni 'visokog' i 'kritičnog prioriteta' (eng. high priority) , uključujući vankomicin-rezistentni Enterococcus faecium i karbapenem-rezistentne Enterobacteriaceae izolirani su iz obalnih područja zahvaćenog otpadnim vodama, što ukazuje na njihovo širenje u morskom okolišu putem kanalizacije. Gen za karbapenemazu bla_KPC-2 je najčešće identificiran kod svih izolata, a slijede ga bla_OXA-48 i bla_VIM-1. Treba napomenuti da su dva izolata C. freundii i po jedan izolat K. pneumoniae, K. variicola i E. asburiae istovremeno nositelji sva tri identificirana gena za karbapenemaze što je po prvi put zabilježeno kod ovih vrsta u morskom okolišu.

Stjecanje ovih gena za karbapenemaze kod okolišnih izolata moglo bi se povezati s povećanom upotrebom karbapenemskih antibiotika u klinici u Hrvatskoj kao i povećana prevalencija bla_KPC-2-pozitivnih enterobakterija u KBC-u Split. Enterobacteriaceae izolati nosili su karbapenemaza-kodirajuće gene (bla_KPC-2, bla_OXA-48 and bla_VIM-1) na različitim konjugacijskim plazmidima što pogoduje njihovom horizontalnom širenju, a što je potvrđeno eksperimentima konjugacije i de novo sekvenciranjem plazmida. Ovi rezultati pokazuju složeni obrazac AR duž trofičkog gradijenta i važnost antropogenog utjecaja za njezino širenje u morskim ekosustavima, te nužnost sveobuhvatnih strategija usklađenih s paradigmom Jednog zdravlja radi rješavanja problema AR u okolišu. 

Abstract:

Bacterial Antibiotic Resistance (AR) is a global issue, and in line with the "One Health" concept, it is important to conduct simultaneous monitoring and control in the entire natural environment. Seas and oceans are the largest ecosystems in the world, but they are the least studied in terms of resistome composition and the main pathogenic carriers of AR.

The aim of this doctoral thesis was to investigate the seasonal and spatial characteristics of AR in marine microbial communities along a trophic gradient in the central Adriatic, spanning 68 km from the Jadro River estuary, influenced by wastewater, to the coastal and open sea.Field research profiled eighty microbiomes using 16S rRNA sequencing, determining the taxonomic composition of the indigenous marine community and the resistome at the bottom and surface of the water column.

It was found that biogeographical shifts are greatly influenced by seasonal changes, particularly thermohaline stratification and the presence of organic matter. The richest composition and diversity of marine microbiomes were observed in areas of high anthropogenic activity, while the most distant measurements from the shore showed lower taxonomic diversity. Anthropogenic influences were found to significantly shape microbial diversity. During winter, under the influence of land-based wastewater, the phyla Proteobacteria and Firmicutes prevailed along the trophic gradient and were the main contributors to the marine resistome. The most abundant pathogenic genera at the surface of the eutrophic area during summer were Arcobacter, Acinetobacter, Bacteroides, Prevotella, Pseudomonas, and Streptococcus, which is a direct consequence of wastewater inflow. Consequently, these genera, particularly Arcobacter, Acinetobacter, Bacteroides, and Pseudomonas, significantly contributed to AR in the coastal area. Targeted AR genes were quantified using RT-qPCR, among which the distribution of tetA, bla_CTX-M, and bla_TEM was correlated with higher temperatures, nutrient loads, and lower salinity.

High priority and critical priority pathogens, including vancomycin-resistant Enterococcus faecium and carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, were isolated from coastal areas affected by wastewater, indicating their spread into the marine environment via sewage. The bla_KPC-2 carbapenemase gene was most commonly identified in all isolates, followed by bla_OXA-48 and bla_VIM-1. Notably, two Citrobacter freundii isolates, and one isolate each of Klebsiella pneumoniae, Klebsiella variicola, and Enterobacter asburiae simultaneously carried all three identified carbapenemase genes, marking the first such occurrence in these species in the marine environment. The acquisition of these carbapenemase genes by environmental isolates could be linked to the increased use of carbapenem antibiotics in clinical settings in Croatia and the higher prevalence of bla_KPC-2-positive Enterobacteriaceae in the University Hospital Centre Split. Enterobacteriaceae isolates carried carbapenemase-encoding genes (bla_KPC-2, bla_OXA-48, and bla_VIM-1) on various conjugative plasmids, facilitating their horizontal spread, as confirmed by conjugation experiments and de novo plasmid sequencing.

These results demonstrate the complex pattern of AR along the trophic gradient and the importance of anthropogenic influence on its spread in marine ecosystems, highlighting the necessity for comprehensive strategies aligned with the One Health paradigm to address the issue of AR in the environment.