1. komponenta

Vrsta nastave	Ukupno
Vježbe u praktikumu	60

* Opterećenje je izraženo u školskim satima (1 školski sat = 45 minuta)

SADRŽAJ PREDMETA:
1. Transformacija bakterijskog soja rekombinantnim plazmidom. Optimalizacija indukcije prekomjerne ekspresije proteina variranjem temperature, koncentracije induktora i vremena indukcije. Provjera prekomjerne ekspresije proteina SDS-gel elektroforezom.
2. Izolacija ukupnih staničnih proteina iz induciranih bakterija. Pročišćavanje prekomjerno eksprimiranog proteina s afinitetnim privjeskom koristeći metodu afinitetne kromatografije. Analiza frakcija elektroforezom u denaturirajućim uvjetima.
3. Izmjena pufera dijalizom i gel-filtracijskom kromatografijom. Ugušćivanje pročišćenog proteina. Spektrofotometrijsko određivanje koncentracije proteina. Testiranje aktivnosti pročišćenog proteina.
4. Izolacija specifične proteaze (npr. proteaza TEV) i odstranjivanje afinitetnog privjeska (npr. His-privjeska). Usporedba aktivnosti proteina sa i bez afinitetnog privjeska.
5. Ispitivanje interakcija proteina i nukleinske kiseline poliakrilamidnom gel-elektroforezom u nativnim uvjetima. Bojanje proteina i nukleinskih kiselina srebrom.
6. Specifična detekcija interakcija protein-protein in vitro koristeći metodu supročišćavanja afinitetnom kromatografijom (engl. pull down). Specifična detekcija proteina western-analizom.
7. Određivanje Kd fluorescencijom. Ideja je da druga skupina studenata radi vježbu 7 umjesto 5 i(ili) 6. Vježba 7 ovisi o dostupnosti instrumenta i fluorofora, i možda se neće izvoditi svake godine.

ISHODI UČENJA:
1. Samostalno izvoditi metode vezane uz nadekspresiju proteina, pročišćavanje proteina i analizu nekovalentnih interakcija proteina s nukleinskim kiselinama ili nekim drugim proteinima.
2. Transformirati i lizirati bakterijske stanice.
3. Pokazati razumijevanje načina optimalizacije indukcije nadekspresije proteina.
4. Pročistiti nadeksprimirane proteine s afinitetnim privjeskom pomoću afinitetne kromatografije.
5. Ukoncentrirati protein, izmijeniti pufer u kojem se protein nalazi, odrediti koncentraciju proteina, odstraniti afinitetni privjesak
6. Analizirati nekovalentne interakcije proteina elektroforezom u nativnim uvjetima i supročišćavanjem afinitetnom kromatografijom
7. Vizualizirati proteine i nukleinske kiseline bojanjem srebrom.
8. Specifično detektirati proteine western-analizom.
8. Pokazati razumijevanje osnovnih principa fluorescencijske spektroskopije i njene primjene na istraživanja proteina, te tehnika obilježavanja proteina odgovarajućim fluoroforom.

1. Interna skripta za Viši praktikum biokemije (2. radno izd.), Zavod za biokemiju, PMF, Zagreb 2013.
   pET System Manual (11. izd.), Novagen, 2005.
   Relevantna poglavlja iz knjige R. R. Burgess, M. P. Deutscher (ur.), Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification (2. izd.), Elsevier, 2009.
   Relevantna poglavlja iz knjige J. R. Lakowicz,Principles of Fluorescence Spectroscopy (3 izd) Springer, 2006.
   Odabrani izvorni i revijalni znanstveni radovi
2. A. Ambriović Ristov (gl. ur.), Metode u molekularnoj biologiji, Institut Ruđer Bošković, Zagreb, 2007.
   J. Sambrook i D. W. Russell, Molecular Cloning: a laboratory manual (3. izd.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
   S. B. Primrose i R. M. Twyman, Principles of Gene Manipulation and Genomics (7. izd.), Blackwell Publishing, 2006.
   L. Stryer, J. Berg i J. Tymoczko, Biokemija (6. izd), Školska knjiga, 2013. (prijevod na hrvatski jezik)
   J. M. Berg, J. L. Tymoczko i L. Stryer, Biochemistry (7. izd.), W. H. Freeman & Co, New York, 2012.
   D. L. Nelson i M. M. Cox, Lehninger Principles Of Biochemistry (6. izd.), W. H. Freeman & Co, New York, 2013.

Izborni predmeti - Redovni Studij - Molekularna biologija